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二代測序快速DNA建庫試劑盒（Illumina）說明書

NGS Fast DNA Library Prep Set

for Illumina

二代測序快速DNA建庫試劑盒（Illumina）說明書

目錄號：K2585

運輸條件：干冰運輸。

保存條件：-20℃保存。

組分說明

       Size                                10        24         96

       End Prep Enzyme Mix                20μl      48 μl      192 μl

       10x End Repair Reaction Buffer     80μl      200 μl     800 μl

       T4 DNA ligase                      20μl      48 μl      192 μl

       T4 DNA ligase Buffer               160μl     400 μl   2×800 μl

       HiFidelity 2×PCRMasterMix          250μl     600 μl   2×1.2 ml

              本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　本試劑盒提供了DNA文庫構建所需要的酶預混體系及反應緩沖液，包含除接頭與PCR引物外的所有成分，用于illumina二代測序平臺DNA文庫構建。和一般建庫方法相比，該試劑盒操作簡單、方便，極大地縮短了文庫構建時間。另外，試劑盒采用高保真DNA聚合酶進行文庫富集，無偏好的 PCR擴增，擴大了序列的覆蓋區(qū)域，可高效制備用于illumina二代測序平臺的DNA文庫。試劑盒中提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證，最da程度上保證了文庫構建的穩(wěn)定性。

產(chǎn)品特點

·末端補平，磷酸化，加A一步完成。

·不需純化，直接加接頭。

·超保真擴增，最da程度上降低了擴增偏好性。

·支持多種樣本，且所得文庫能夠用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq  2500/2000

  /1000和MiSeq sequencing等測序平臺的測序。

自備儀器、試劑和耗材

1．磁力架：建議使用DynaMag            TM-2

                                 (Cat.No. 12321D)。

2．DNA純化回收試劑盒：建議使用研謹磁珠法DNA純化回收試劑盒 (Cat.No. K2508)。

3．樣本接頭引物試劑盒：建議使用研謹二代測序多樣本接頭引物試劑盒   I/II (Cat. No.

   K2586/K2587）。

4．無水乙醇，EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去離子水（pH 在7.0-8.0之間）。

5．反應管：建議使用低吸附的PCR管與1.5 ml離心管；

   槍頭：建議使用高質(zhì)量過濾槍頭防止試劑盒、文庫樣本污染。

實驗前準備及重要注意事項

1．避免試劑的反復凍融。

2．PCR產(chǎn)物因操作不當極易產(chǎn)生污染，導致實驗結果不準確，建議將PCR反應體系配制區(qū)與PCR產(chǎn)物純化區(qū)隔離，并使用專門的移液器，定時對各實驗區(qū)域進行清潔。

DNA建庫流程示意圖

  2小時40分鐘得到DNA文庫

1.  DNA末端修復（~50min）

2.  Adaptor連接（~15min）

3.連接adaptor后的DNA片段的選擇性回收

    4.PCR擴增 （~15min）

    5.PCR產(chǎn)物純化 （30min）                              

補平、磷酸化、加A一步完成

         兩步操作一管完成

操作步驟

樣本要求：  5ng-1μg打斷的雙鏈DNA，溶于EB（10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去離子水中。

DNA純度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修復反應

1．向200μl PCR管中加入以下試劑：

                 試劑名稱                             體積

                 10x End Repair Reaction Buffer     6.5μl

                 End Prep Enzyme Mix              2μl

                 fragmented DNA                   X（5ng-1μg）

                 RNase-free Water                 Up to 65μl

2．用槍頭將上述溶液輕輕吹吸混勻，短暫離心,使所有組分收集到管底。

3．將上述PCR管置于PCR儀中，熱蓋打開，反應程序如下：

        15 min @ 12℃

        15 min @ 37℃

        20 min @ 72℃

        Hold on 4℃

Adaptor連接

建議使用研謹adaptor進行連接，也可選擇使用NEB、illumina公司的adaptor，具體連接方法可參考各公司的產(chǎn)品使用說明書。以下為使用研謹adaptor進行連接的操作步驟：

1．向上述已完成DNA末端修復的反應液中直接加入以下試劑：

試劑名稱                            體積

T4 DNA ligase buffer for illumina        14  μl

T4 DNA ligase                        2  μl

Adaptor                             2.5  μl

   此時管中溶液總體積為83.5 μl。

   注意：若起始樣本量少于100 ng，請將adaptor用去離子水稀釋10倍至1.5 μM后使用。

2．用槍頭將上述試劑吹吸混勻，短暫離心，使溶液收集到管底。

3．20℃溫浴15分鐘。

   注意：若此操作使用pcr儀，請將熱蓋關閉。

DNA_-#片段的選擇性回收

建議使用上海研謹磁珠法DNA純化回收試劑盒（K2508）進行DNA+#片段選擇性回收。

注意：DNA+#片段選擇性回收是可選步驟，若起始樣本量低于50ng，不建議進行DNA+#片段選擇性回收，可參考說明書第4頁，直接進行DNA+#片段的純化。另外構建不同大小的DNA文庫時，DNA+#片段選擇性回收的磁珠使用量不同，具體磁珠用量可參照附表1（若使用除研謹以外廠家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量）。

以下操作步驟中，可選擇回收DNA+#片段長度峰值為320bp（插入片段長度200bp），反應起始體積為100 μl。

1．渦旋振蕩CMPure20秒，使其*混勻為均一溶液。

2．向連接反應液中加入16.5 µl去離子水，使adaptor連接反應緩沖液體積至100μl。

   注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去離子水。

3．將上述adaptor反應緩沖液轉移至一新的1.5ml離心管中。

4．加入60 µl混合均勻的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后, 室溫靜置5分鐘。

5．短暫離心，將離心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5 分鐘），小心地將上清溶液轉移

至新的1.5 ml離心管中,并棄去磁珠。

   注意：不要棄除上清。

6．向上清中加入20 µl混合均勻的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后室溫放置5分鐘。

7．短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5分鐘），小心吸取上清并棄除，期

間避免接觸已結合目標DNA的磁珠。

   注意：不要棄除磁珠。

8．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入250 µl新配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠*吸附

后，小心棄除上清。

9．重復步驟8。

10.保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。

11.將離心管從磁力架上取下，加入 28 µl 10 mM  Tris-HCl（pH 8.0）或去離子水（自備），渦旋振蕩使磁珠*重懸于洗

脫液中，室溫靜置5分鐘。

12.短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清（約需 5分鐘），將23 μl洗脫液轉移至一個新的PCR管中；

   注意：一定不要轉移磁珠，微量磁珠污染可影響后續(xù)PCR反應的正常進行。

另一種方案：DNA+#片段的純化

1．渦旋振蕩CMPure20秒，使其*混勻為均一溶液。

2．將adaptor連接反應液轉移至一新的1.5 ml離心管中。

3．加入1倍樣品體積的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后，室溫靜置5分鐘。

4．短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5分鐘），小心吸取上清并棄除，期

間避免接觸已結合目標DNA的磁珠。

   注意：不要棄除磁珠。

5．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入 250 µl新鮮配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠*吸附

后，小心棄除上清。

6．重復步驟5。

7．保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。

8．將離心管從磁力架上取下，加入28 µl EB（自備）或去離子水，渦旋振蕩使磁珠完全重懸于洗脫液中，室溫靜置5鐘。

9．短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清（約需 5分鐘），將23 μl洗脫液轉移至一個新的PCR管中。

PCR擴增

1．在PCR管中加入以下試劑并混勻。

                       試劑名稱                          體積

                       連接adaptor后的DNA片段              23 μl

                       HiFidelity 2X PCR Master Mix          25 μl

                       Univesial primer                      1 μl

                       Index primer                         1 μl

                       總體積                           50 μl

2．PCR反應條件。

                    步驟              溫度             時間

                    預變性             98℃            30 s

                    變性              98℃            10 s

                    退火              65℃            30 s    6-16個循環(huán)

                    延伸              72℃            30 s

                    終延伸             72℃            5 min

注意：建議1 μg樣本起始量時PCR循環(huán)數(shù)為6個循環(huán)，50 ng時10個循環(huán)，5 ng時14-15個循環(huán)，PCR循環(huán)數(shù)也可根據(jù)實驗需

要進行優(yōu)化。

PCR產(chǎn)物的純化

1．渦旋振蕩CMPure20秒，使其*混勻為均一溶液。

2．將PCR反應液轉移至一新的1.5 ml離心管中。

3．加入1倍樣品體積的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后室溫靜置5分鐘。

4．短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5分鐘）。小心吸取上清并棄除，期

間避免接觸已結合目標DNA的磁珠。

   注意：不要棄除磁珠。

5．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入 250 µl新鮮配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠*吸附

后，小心棄除上清。

6．重復步驟5。

7．保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。

8．將離心管從磁力架上取下，加入30 µl EB（自備）或去離子水，渦旋振蕩使磁珠*

   重懸于洗脫液中，室溫靜置5分鐘。

9．短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清（約需5分鐘），將洗脫液轉移至一

   個新的PCR管中約25 μl，DNA文庫在-20℃保存。

文庫質(zhì)量檢測

文庫濃度

為了得到高質(zhì)量的測序結果，需要對 DNA文庫進行精確定量，首先推薦使用Real-timePCR方法對DNA文庫進行絕對定量。

此外，還可使用熒光染料法，如Qubit法或熒光染料picogreen法，此處請勿使用基于吸光度測量的定量方法。最終可使用以

下近似公式換算DNA文庫的摩爾濃度。

          文庫平均總長度       近似轉換公式       成簇反應 DNA文庫濃度

                  200 bp       1 ng/μl=7.5 nM        6-12 pM

                  300 bp       1 ng/μl=5.0 nM        6-12 pM

                  400 bp       1 ng/μl=3.8 nM        6-12 pM

                  500 bp       1 ng/μl=3.0 nM        6-12 pM

文庫長度分布

制備好的DNA文庫可用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100 Bioanalyzer檢測DNA文庫中的片段長度分布范圍。

 L   S

 圖1：Agilent 2100 Bioanalyzer文庫分析結果

 L：DNA Ladder；

S：使用200ng人基因組DNA構建文庫，磁珠進行選擇回收后結果。

    文庫結構

    5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC

    GATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNN

    NNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

    NNNNNN：index, 6bases

實驗代做服務：